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inscopix专偶动物大脑中的神经生物特点

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专偶动物大脑中的神经生物特点

----Inscopix nVista神经元成像系统应用

 

爱情在人类社会中一直是一个热度经久不衰的话题,历史自有记载以来就不缺乏对其的描写。它为人类文化贡献了极为灿烂的一部分。同其他具有个体差异的人类特点一样,有的人专情,有的人滥情,但不同的是我们的文化有很大一部分专门对其进行了阐释和延伸,如对礼教和家庭的,如此以来,人类的感情生活便深刻受到文化的影响。

 

通过一直以来对大脑的研究,现在我们相信爱情是大脑生化和电活动的一种产物。但除去人类,自然界中的各种动物对爱情生活也是差异巨大,比如部分哺乳动物是遵从一夫一妻制,部分是一夫多妻制,还有一部分是自由散漫的状态。只有不到10%的哺乳动物(包括人类),其个体形成了基于交配的成对生活。这些动物倾向于在长时间里与伴侣一起活动并因此维持且加强了它们的情感连结。据此,我们有理由相信,生物的爱情状态是可塑的,在它们的大脑中肯定有一些特定的编码控制这些不同状态的神经组织形式。

 

但它们大脑是怎样组织这些感情以及如何影响生活的,怎样去研究这些?在技术手段比较简单的时期,这种研究确实很多只能停留在猜想的阶段,无法探索更深层的机制。现在已经有了可以大规模直观的观察神经元电活动的技术,使我们能够更深层次的探索其背后的神经调控机制。

 

最近,一个研究团队在《PNAS》上发表了的一篇文章,对这个问题尝试进行了解答。

 

伏隔核在奖励和动机响应中扮演的重要角色使其成为研究人员候选的编码伴侣-奖励通路的重点区域。在人身上,进行功能性MRI的志愿者在认为他们正握着伴侣而非陌生人的手时,他们NAc中的血氧信号会增强。在草原田鼠中,毁损这个区域的神经调节信号会损伤他们连结的形成,但接下来的基因表达会使连结得以维持。此外,在不交配的情况下,激活前额叶到NAc的神经通路足以诱导连结的形成。尽管有大量证据表明NAc在编码伴侣连结中起主要作用,但其背后的神经机制以及它随着关系进展如何变化仍然未解。因此,研究人员在草原田鼠交配前后,在自由活动状态下对NAc的神经钙活动进行了在体成像记录,以了解大脑在连结形成、成熟时的活动变化。

 

实验之所以采用草原田鼠,是因为它在交配上是一夫一妻制,这样先天自然存在的专偶物种是研究感情背后生物机制的最JIA研究对象,其配对测试很容易评估。

 

实验开始,首先往实验鼠的脑内注射钙指示病毒,埋置微型显微镜,实验时设置一个3格实验盒,左右两边的格间分别拴系配偶和陌生的两个鼠,左边是配偶,右边是陌生鼠,实验动物放置起始位置是中间室,可自由进入两边的格间活动。实验中,试验动物需要在拴于格子两端的“旧伴侣”和“陌生鼠异性”之间做出选择。这个测试提供了一个研究固定伴侣动物的神经活动及其神经——行为关系的方法。

 

研究人员使用格罗贝尔生物的Inscopix nVista单光子微型显微镜,结合使用病毒载体的突触蛋白启动的GCaMP6f,在自由活动情况下对NAc的神经活动进行钙活动成像(图1A–E)。实验一共采用了17只鼠,7雄10雌。开始在30只鼠上埋植了透镜,其中有26只在手术后4周可见荧光。其中一部分动物因为以下原因被剔除:透镜埋植在NAc区以外(1只),小于5个可观测推定细胞(1只),在任何一个伴侣偏好测试中都没有检测到偏好性(3只),其他视野遮挡/运动伪影/技术问题(4只)。平均来说,每次记录时每只动物能检出43±20个细胞。ANOVA检验显示,在长跨20天的3次记录中,平均细胞数目没有改变。对每次记录的前60s和最后60s的每个细胞取平均ΔF/F0值,在这一阶段,动物是单笼饲养,没有施加刺激,得到的信号作为实验的神经本底活动水平。在成像的每个时间点之间,得到的平均ΔF/F0值都没有显著差异。结合前后两个分析点,针对每个时间点每只动物得出一个ΔF/F0本底值。

 

图1,在一夫一妻制的草原田鼠身上进行的钙成像实验

 

成像期间,实验动物的伴侣偏好明显

 

在伴侣偏好测试中,实验鼠会特征性的偏好选择与单一伴侣进行互动。我们在田鼠情感连结形成的全过程中选取3个时间点进行20min伴侣偏好测试,并对其进行了钙成像记录。第YI个时间点在田鼠尚未性成熟(day0),第二个在田鼠交配和同居短时间后(day6),第三个是田鼠交配和同居长时间后(day20)(图1G)。如预期,幼鼠在配偶前没有表现出伴侣偏好好,在配偶同居之后,显示并增强了伴侣偏好。特别是在长期同居后,田鼠在伴侣身边花的时间比陌生鼠更多(图1)。相应的,它同伴侣以及陌生鼠周围逗留的时间长度与实验时期高度相关。交配后,田鼠在伴侣旁单词逗留的时长也高于陌生鼠(图1I和2A)。他们还检查了实验鼠分别在伴侣和陌生鼠房间逗留时与被拴田鼠的平均距离。发现在配偶后,实验鼠跟伴侣鼠靠得更近(图1J)。因此在整个互动环节,在平均社交时长和与拴系鼠的距离上,均显示了伴侣偏好的形成。这些数据显示长时间同居会引起更强壮的情感连结,这也引出了另一个问题:情感连结的增强是否在NAc神经活动也上有所显示?

 

由于担心记录时间过短和成像记录附着物可能会影响伴侣偏好性的检测,因此,在同居短时间和长时间两个点(days 7 and 21)进行成像记录后,研究人员接着进行了常规3小时的伴侣偏好实验。在前后两个测试中均观察到了伴侣偏好,还发现与伴侣互动时间占总时间的比例在两个时间点是相关的,这在成像期间的实验中没有发现。与20-min测试不同,短期同居小鼠在3小时实验中对伴侣的偏好也很明显。这表明了常规3小时伴侣偏好实验比前面的20分钟实验更敏感和稳定,总体来说,这些数据确认了田鼠在配对和同居后对伴侣的偏好开始产生并持续增强。

 

实验鼠在与拴系的伴侣和陌生鼠进行互动时,NAc神经元群体活动没有改变

基于人类神经成像的研究,研究人员假设一个已经配对的田鼠在和伴侣互动时,NAc神经活动会比和陌生人互动要高很多。但在记录全部的钙事件后,经过对数据进行变量控制处理,数据结果并不能倒推与实验鼠互动的是伴侣鼠还是陌生鼠。他们将实验中持续至少1s的互动行为称作一次社交。幼年期田鼠对两个陌生鼠的单次社交时长没有变化;在配对后,实验鼠和伴侣互动的社交时长明显比同陌生鼠的长(图2A)。用其他计量标准衡量实验鼠与伴侣及陌生鼠的社交时长差异(图1H–J),也发现同居、配对时间越久,差异越明显(图2A)。

 

图2,实验鼠在情感连结建立前后,在与不同的拴系鼠进行互动的全程均有强烈的神经钙活动

 

他们发现细胞群的平均钙活动发生率在第YI次社交和在单次社交的起始时比较高(图2B–D)。田鼠在与伴侣互动时,社交时长比与陌生鼠的长(图2A)。要弄清楚这些差异的影响,他们选择用一个混合效应模型,因为它完美的支持多协变量并且比标准线性模型可以更鲁棒的兼容结构数据。他们把单次社交时长,社交次数,及不同成像阶段,针对不同鼠,性别均设立固定权值,来实验确定哪个变量对神经活动起着显著的影响。发现NAc在社交时有强活动,但在除去社交次数和社交时长两个变量后,发现实验鼠分别与伴侣和陌生鼠互动时的平均神经活动并没有差异。经过一系列实验,结果发现,大脑NAc编码这种情感连结的不会是神经元群的活动强弱变化。

 

“靠近细胞”群的扩张可以反映伴侣偏好的出现

那么是否有特定的神经元亚群可以调控田鼠的这种伴侣偏好呢?他们根据实验鼠与伴侣或陌生鼠的靠近和离去所伴随的神经元钙事件响应分别推定不同功能神经元。对每个房间,计算每个钙事件发生后的1秒内,实验鼠与刺激鼠的距离中值(图3A)。将观察到的距离变化与分别在伴侣和陌生鼠房间内逗留时钙事件随机重复的距离变化空模型进行比较(图3A)。通过变换给定细胞钙事件与动物行为的绑定,打乱钙事件与行为之间的任何统计关系,随机量化事件模式的可能种类。他们在每次随机变换事件后,统计距离变化中值来生成一个空分布,重复了1000次。当细胞事件响应的动物距离变化≥95%的空分布时,细胞被认为是调控“离去”行为的细胞,≤5%的空分布时则是主管“靠近”的细胞(图3B)。因此,每个细胞都被分别分到与伴侣或陌生鼠相关的“靠近”,“离去”或“中立”组(图3C-F)。

 

图3,在连结成熟时“靠近细胞”的数量增加

 

只有在实验中有钙事件的细胞可能会是“靠近”或“离去”细胞。因此在统计“靠近”或“离去”细胞比例时用实验中至少有一次钙事件的细胞总数作分母。在记录期间研究人员发现“靠近伴侣”细胞数量有扩增(图3G)。幼鼠尚未配偶,脑中没有发现“靠近伴侣”细胞、“靠近陌生鼠”细胞,配偶后开始出现两种细胞的差异,同居长时间后变得更加明显,正符合情感连结发展成熟过程。而长同居时,“靠近伴侣”细胞比“靠近陌生鼠”细胞的数量显著更多。

 

研究人员也检验了实验鼠分别对于伴侣和陌生鼠的“靠近”,“离去”细胞数量与实验鼠的伴侣偏好强度是否相关。在长期同居时间点,实验鼠伴侣偏好较强,他们发现对于伴侣和陌生鼠“靠近”细胞的数量与伴侣偏好强度存在显著正相关(图3I)。

相反,实验鼠对于伴侣和陌生鼠的“离去”细胞数量在任何时间点都没有差异(图3H)。同样,对于伴侣和陌生鼠“离去”细胞数量的差异与实验鼠的伴侣偏好强度也没有显著相关性(图3J)。

 

Inscopix的nVista™和nVoke™解决方案在世界重要刊物上已发表120+篇文章,使科学家们对大脑有了更深刻的认识,在自由移动的动物中绘制新的大脑神经回路。

 

靠近/离去细胞的活动主要发生在行为做出之前。

 

研究人员发现,大多数靠近和离去细胞在动物发生社交接触或离去行为之前已经表现出事件,这表明这些细胞可能会调控接近或离去拴系动物决策的发生。为了准确判定靠近细胞活动是否主要发生在靠近过程中或靠近行为之前,我们进行了相同的排列分析,计算了Ca2 +事件之前1 s的测试动物与刺激动物之间的距离变化,以识别发生事件的细胞。

 

靠近细胞群没有重叠,而离去细胞群重叠。

 

实验鼠对于伴侣和陌生鼠的靠近细胞是否属于不同的群?研究人员进行了排序分析,并对细胞身份进行了标定以计算不同功能亚群之间潜在的分布重叠。通过与空分布进行比较,发现实验鼠对伴侣和陌生鼠的“靠近”神经元重叠不大于随机情况(图4A),表明即使在交配/结合之前,这些细胞也可以分属于各自不同的集合。令人惊讶的是,实验鼠对伴侣和陌生鼠的“离去”细胞重叠大于随机情况(图4B)。“离去”细胞群的重叠,表明根据这种轨迹标准不能准确的定义区分“离去”细胞。

 

图4,“靠近”和“离去”细胞群的特点

 

“靠近”和“离去”细胞群缺乏拓扑组织

 

根据神经细胞在解剖学上的位置分布可以一定程度上洞悉一个神经网络的编码行为及其信息处理方式。对于处理高阶认知的网络,已经观察到有群集或分布式的蜂窝组织。如网格细胞在内侧内嗅皮层内显示有功能性的微组织和聚类存在。先前在NAc的研究表明,强啡肽+神经元可能存在某种空间组织,参与调节食欲和厌恶反应。因此,研究人员探究靠近和离场细胞是否在NAc内也存在某些空间组织。

 

他们在长期时间点计算了每只动物中同一身份的每个可能细胞对之间的距离,并将这些值与不符合身份分类标准的所有细胞间距进行了比较(图4C)。发现陌生鼠靠近,陌生鼠离去和同伴鼠离去细胞对均与未分类细胞的间距分布无明显差异。同伴鼠靠近细胞对的间距确实存在显着差异,但是这些对之间的距离往往更远而不是更近,这表明神经组织形式高度分散。为了进一步确认NAc中不存在较小规模的组织模式(例如空间隔离的簇),我们还针对给定的成像视野计算了具有相同身份的最邻近细胞对的间距。在所有实验鼠中,只有6.81%的最近邻细胞对比随机情况更近。这些结果表明,NAc中关于陌生鼠和伴侣的细胞群不是显示聚类,而是以空间分布的模式存在。

 

研究人员在在较少数量的动物身上就获取了大量的神经元钙活动信息,进而通过数学方法,根据对大脑内钙活动模式的分析,从一群细胞的钙活动信号里分出了细胞亚群,并且找到了其亚群各自专属的调控功能,其研究方法可圈可点。

 

(由格罗贝尔生物科技公司供稿,未经同意不得转载)

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